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BUNSEN本生帶你全面了解——ELISA實驗的基本知識

更新時間:2023-09-01    點擊次數(shù):3279

  BUNSEN本生帶你全面了解——ELISA實驗的基本知識
 

  基本類型:

  酶聯(lián)免疫吸附試驗 (以下簡稱ELISA) :是酶免疫測定技術(shù)中應(yīng)用的技術(shù)。其基本方法是將已知的抗原或抗體吸附在固相載體 ( 聚苯乙烯微量反應(yīng)板 )  表面,使酶標(biāo)記的抗原-抗體反應(yīng)在固相表面進(jìn)行,用洗滌法將液相中的游離成分洗除。常用的 ELISA  法有雙抗體夾心法和間接法,者用于檢測大分子抗原,后者用于測定特異抗體。BUNSEN本生Elisa試劑盒

  用途:

  根據(jù)ELISA所用的固相載體而區(qū)分為三大類型:一是采用聚苯乙烯微量板為載體的ELISA,即我們通常所指的ELISA(微量板ELISA);另一類是用硝酸纖維膜為載體的ELISA,稱為斑點ELISA(Dot-ELISA);再一類是采用疏水性聚脂布作為載體的ELISA,稱為布ELISA(C-ELISA)。在微量板ELISA中,又根據(jù)其性質(zhì)不同分為間接ELISA、雙抗體夾心ELISA、雙夾心ELISA、競爭ELISA、阻斷ELISA及抗體捕捉ELISA。

  操作程序:

  1、間接ELISA

  本法主要用于檢測抗體。以鴨病毒性肝炎(DVH)抗體的ELISA為例,間接ELISA的操作程序如下:

  (1) 材料

 ?、?包被液、洗滌液、保溫液、底物液、終止液;

 ?、?DVH包被抗原、酶標(biāo)抗抗體、陰性及陽性DVH參考血清;待檢鴨血清;

  ③ ELISA檢測儀、加樣器、聚苯乙烯微量板。

  (2) 方法步驟

 ?、?加抗原包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干

 ?、?加待檢血清 → 37℃ 2小時,洗滌三次、拋干

 ?、?加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 2小時,洗滌三次、拋干

 ?、?加底物液 → 37℃ 30分鐘,加終止液

 ?、?用ELISA檢測儀測定OD值,并計算出P/N比值。

  (3) 結(jié)果判定  已知陽性血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1,而且已知陽性血清的OD值≥0.4;在上述條件成立的情況下,如果待檢血清與已知陰性血清的比值(P/N)≥2.1,而且待檢血清的OD值≥0.4,則判為陽性,否則判為陰性。

  2、雙抗體夾心ELISA

  本法主要用于檢測大分子抗原?,F(xiàn)以檢測雞傳染性法氏囊病病毒(IBDV)的雙夾心抗體ELISA為例介紹本法的操作程序。

 ?、?加抗體包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干

  ② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘,洗滌三次、拋干

 ?、?加酶標(biāo)抗體 → 37℃ 30分鐘,洗滌三次、拋干

 ?、?加底物液 → 37℃ 15分鐘,加終止液

 ?、?用ELISA檢測儀測定OD值。

  3、雙夾心ELISA

  此法與雙抗體夾心ELISA的主要區(qū)別在于:它是采用酶標(biāo)抗抗體檢查多種大分子抗原,它不僅不必標(biāo)記每一種抗體,還可提高試驗的敏感性。

  此法的基本程序為:

  ① 加抗體(Ab-1)包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干

 ?、?加待檢抗原(Ag) → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干

  ③ 加用非同種動物生產(chǎn)的特異性抗體(Ab-2)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干

 ?、?加入酶標(biāo)抗Ab-2抗體(AB-3)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干

 ?、?加底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液

 ?、?用ELISA檢測儀測定OD值。

  4、競爭ELISA

  此法主要用于測定小分子抗原及半抗原,其原理類似于放射免疫測定。

  其基本程序為:

 ?、?抗體包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干

 ?、?加入待檢抗原及一定量的酶標(biāo)抗原(對照孔僅加酶標(biāo)抗原)→ 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干

 ?、?加底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液

 ?、?用ELISA檢測儀測定OD值。

  被結(jié)合的酶標(biāo)抗原的量由酶催化底物反應(yīng)產(chǎn)生有色產(chǎn)物的量來確定,如果待檢溶液中抗原越多,被結(jié)合的標(biāo)記抗原的量就越少,有色產(chǎn)物就減少,這樣根據(jù)有色產(chǎn)物的變化就可求出未知抗原的量。此法的優(yōu)點在于快速、特異性高、且可用于小分子抗原及半抗原的檢測;其主要不足在于每種抗原都要進(jìn)行酶標(biāo)記,而且因為抗原的結(jié)構(gòu)不同,還需應(yīng)用不同的結(jié)合方法。此外,試驗中應(yīng)用酶標(biāo)抗原的量較多。

  5、阻斷ELISA

  本法主要用于檢測型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎(TGE)、豬偽狂犬病(PR)及豬胸膜肺炎(AP)的主要檢測方法。

  下面以AP2型抗體的阻斷ELISA檢測法為例介紹其操作程序:

 ?、?100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃過夜,洗滌三次、拋干

 ?、?用200μl阻斷緩沖液進(jìn)行封閉 → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干

 ?、?加工作量1:4稀釋被檢豬血清100μl → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干

 ?、?加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分鐘,洗滌三次、拋干

 ?、?加100μl工作量豬抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分鐘,洗滌三次、拋干

  ⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分鐘,加終止液

  ⑦ 用ELISA檢測儀測定OD值。

  本試驗同時設(shè)標(biāo)準(zhǔn)陰、陽性血清對照、兔抗AP2型陽性對照、空白對照。

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