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本生帶您分析影響ELISA中非特異性顯色的原因

更新時(shí)間:2023-08-08    點(diǎn)擊次數(shù):1766

  本生帶您分析影響ELISA中非特異性顯色的原因


  影響ELISA中非特異性顯色的原因很多,如試劑盒特異性、檢驗(yàn)標(biāo)本中含酶標(biāo)記物的干擾物,操作過程中的問題。本文就這一原因作一簡(jiǎn)要分析,以便可以通過以上措施把非特異顯色降至zui低限度,從而提高檢測(cè)的特異性,并得到更準(zhǔn)確、可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

  試劑盒特異性因素

  1. 固相載體的選擇。ELISA中常用的固相載體有微量滴定板、小珠和小試管三種,以微量滴定板最為常見[1]。它具有良好的吸附性能,孔底透明度高,空白值低,各板之間、同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯ELISA板由于原料的不同和制作工藝的差別,各產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此,在選擇試劑盒同時(shí)要對(duì)其使用的微孔板型號(hào)進(jìn)行認(rèn)證,評(píng)估。

  2.包被物的純度。在酶聯(lián)免疫測(cè)定尤其是間接ELISA中,試劑的特異性取決于使用抗原的純度。目前由于技術(shù)條件的限制,包被用抗原或抗體的純度不可能達(dá)到100%,所以有些非特異性顯色不可避免,只能盡可能提高純度,提高特異性。目前使用的包被抗原一般為合成多肽抗原。

  3.包被抗體的效價(jià)。具有高親和力和高特異性的包被抗體,是決定試劑特異性的重要方面。

  4 .封閉。是ELISA中重要的一步,目的是封閉固相載體表面尚未被所占據(jù)的空隙,減少后續(xù)步驟中非特異性蛋白的干擾。


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  檢驗(yàn)標(biāo)本中含有酶標(biāo)記物的干擾物

  1.內(nèi)源性干擾物:類風(fēng)濕因子(RF)、黃疸等,類風(fēng)濕因子是可作用于多種動(dòng)物以及人IgGFc段的自身抗體,多數(shù)為IgM類,能充當(dāng)抗原成分與固相及酶標(biāo)抗體反應(yīng),從而呈現(xiàn)非特異性顯色。

  黃疸血標(biāo)本中常含有內(nèi)源性過氧化物酶,如用辣根過氧化物酶為標(biāo)記物,就有可能產(chǎn)生非特異性顯色。

  2 .外源性干擾物,常常因樣品采集、貯存、處理不當(dāng)造成如樣品溶血,被細(xì)菌污染,標(biāo)本凝集不全等。溶血標(biāo)本,紅細(xì)胞溶解破裂,釋放出血紅素形成,而血紅素中的鐵卟啉是過氧化物酶的類似物,以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中,溶血標(biāo)本可能會(huì)增加非特異性顯色。如有細(xì)菌污染,菌體中可能含有內(nèi)源性HRP(辣根過氧化酶)[2],有國內(nèi)報(bào)道酶免HAg試劑檢測(cè)溶血標(biāo)本時(shí)可造成假陽性[3]。如在冰箱中保存過久,其中的IgG可發(fā)生聚合,在間接法ELISA中可使本底加深[2]。因此,血標(biāo)本在采集處理時(shí)應(yīng)小心,在冰箱中保存不易過久。

  標(biāo)本凝集不全時(shí),血清中會(huì)殘留部分纖維蛋白原,也易造成假陽性。

  操作過程中的問題造成假陽性

  1.加樣

  對(duì)于間接ELISA標(biāo)本一般都要進(jìn)行稀釋,如果加樣不準(zhǔn)就會(huì)造成誤差,尤其當(dāng)稀釋倍數(shù)大時(shí),很小的絕對(duì)誤差,會(huì)導(dǎo)致較大的相對(duì)誤差,使陰性(或弱陽性)標(biāo)本呈陽性(或陰性)。加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。目前,大部分血站都已使用全自動(dòng)酶免加樣系統(tǒng)處理標(biāo)本,可較好地避免以上誤差。

  2.洗滌

  在ELISA中正確的洗滌是保證得到可重復(fù)結(jié)果的關(guān)健一步,應(yīng)引起操作者重視。無論是手工操作還是機(jī)器操作,得出不正確的結(jié)果常與不正確的洗滌有關(guān),ELISA就是靠洗滌來達(dá)到分離游離和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。通過洗滌以消除殘留在板孔中沒能與固體抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。

  3 .溫育

  每種試劑都有其最佳反應(yīng)模式,其中溫度和溫育時(shí)間控制是重要因素。因孵育溫度高,反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng),會(huì)造成整板本底高,陽性率高。溫育一般用濕盒或水浴,反應(yīng)板不宜疊放,以保證各板溫度都能迅速平衡,為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋。

  4.酶標(biāo)儀判讀

  作為記錄測(cè)定結(jié)果的儀器,酶標(biāo)儀的性能穩(wěn)定與否,決定結(jié)果的可靠度。首先酶標(biāo)儀應(yīng)定期進(jìn)行保養(yǎng),對(duì)濾光片要定期校正;其次酶標(biāo)儀波長(zhǎng)設(shè)置要正確,最好使用雙波長(zhǎng),一個(gè)檢測(cè)波長(zhǎng),一個(gè)參比波長(zhǎng),以消除微孔板底部劃痕、不平、指印或液面高度差異造成的光干擾。此外,在用酶標(biāo)儀讀數(shù)時(shí)最好先擦試微孔板底部并壓平板條。由于各種酶標(biāo)儀性能有所不同,使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書

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